Wissenschaftliche Testmethoden

Die Arbeitsgruppe ist spezialisiert auf Forschungsarbeiten im Bereich der Toxikologie, Allergologie, Biokompatibilität und Verträglichkeit dentaler Materialien.
Dabei sind folgende wissenschaftlichen Testmethoden im Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie der LMU München, Nussbaumstr. 26, 80336 München, sowie
in der Klinik und Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie der LMU, Goethestr. 70, 80336 München, etabliert, standardisiert und können durchgeführt werden.

Testmethoden

  • Metabolische Untersuchungen
  • Glukoseneubildung aus Pyruvat (Gluconeogenese)

Eine geeignete Methode für Untersuchungen von Einflüssen von Fremdstoffen (Xenobiotika) auf den Metabolismus im Körper (Toxikodynamik) ist die Bestimmung der Neubildung der Glucose (Gluconeogenese) in Zellen. Die Gluconeogenese stellt einen phylogenetisch sehr alten Stoffwechselweg dar. Sie ist für diese Untersuchungen gut geeignet, da sie sehr eng mit vielen Bereichen des zellulären Energiestoffwechsels verbunden ist. Beeinflussungen durch Fremdstoffe können hier weit reichende Folgen haben, weil viele gebildete Intermediate dann nicht mehr in andere Stoffwechselwege einfließen können und somit weitere Schäden folgen.

Erhalten Zellen als Substrat keine Glukose sondern nur Pyruvat, können die Zellen aus Pyruvat Glucose neu bilden (Gluconeogenese). Als Maß für den Grad des Einflusses von Xenobiotika auf den Zell-Metabolismus dient die Höhe dieser Glucoseneubildung. In vorangegangenen Untersuchungen wurde als Zielorgan der akuten Exposition mit den Komposit-Inhaltsstoffen TEGDMA und HEMA die Niere identifiziert. Deshalb wurden die bisherigen Untersuchungen mit Nierenzellen durchgeführt. Gegenstand der Testreihe war/ist die vergleichende toxikologische Bewertung verschiedener Kunststoff- (Ko)Monomere und anderer Zahnwerkstoffe (z.B. Quecksilberverbindungen) am Modell der isolierten Ratten-Nierentubulizellen. Bei diesem Test werden frische präparierte Rattennierentubuli mit den Testsubstanzen bis zu 60 Minuten exponiert. Als Substrat dient Pyruvat. Danach erfolgt die Glucose- und Proteinbestimmung der Zellen. Die Vitalität der Zellen wird durch einen Farbausschlusstest ermittelt.
Es konnten bisher massive Einflüsse von (Ko)Monomeren und Quecksilberverbindungen auf den Zell-Metabolismus gefunden werden.

Synergistische Effekte von Wasserstoffperoxid mit Inhaltsstoffen in Kompositen
Der Wunsch nach weißen Zähnen steigt in der Bevölkerung stark an. Zunehmend werden in der zahnärztlichen Praxis Peroxide zum Bleichen der Zähne verwendet. Meist wird Carba-midperoxid (10-35%) eingesetzt, das äquivalent zu 3-12% H2O2 ist.
Genetisch bedingt und/oder durch iatrogene Einflüsse auf das (anti)oxidative System und/oder erhöhter oxidativer Stress in Zellen können zu einem drastischen endogenen Anstieg von H2O2 im Körper führen, was wiederum Krankheiten auslösen kann. In den vorherigen Experimenten (siehe oben) konnte gezeigt werden, dass zahnärztliche Restaurationsmaterialien die Glukoseneubildung in Nierenzellen beeinflussen können.
In weiteren Versuchen zur Gluconeogenese wurde entdeckt, dass es zu einer synergistischen Wirkung der Toxizität in Nierenzellen von H2O2 nur mit TEGDMA kam. Mit anderen untersuchten zahnärztlichen Materialien (z.B. HEMA, Quecksilberverbindungen) wurden keine synergistischen toxischen Wirkungen mit H2O2 beobachtet. Die Ergebnisse wurden mittlerweile auch im XTT-Test (siehe oben) und mit Gingiva- und Pulpafibroblasten bestätigt.
Die Ergebnisse sprechen zwar nicht für die Entstehung einer systemischen (Schad-)Wirkung bei Personen, selbst wenn sie viele Kompositfüllungen tragen und sich öfters die Zähne bleichen lassen würden. Allerdings muss festgehalten werden, dass vor allem zahnärztliches Personal beim (täglichen) Umgang mit diesen Werkstoffen auch höheren, mitunter auch länger andauernden Konzentrationen ausgesetzt sein können.
Es wird empfohlen, den Einsatz von TEGDMA enthaltenden Restaurationsmaterialien bei Personen mit bekannten Krankheiten, verursacht durch ein geschädigtes (anti)oxidatives System und/oder erhöhtem oxidativen Stress, sorgfältig abzuwägen.

XTT-Test
Dieser Cytotoxizitätstest misst den Einfluss von Fremdstoffen (Xenobiotika) auf die intramitochondriale Dehydrogenase-Aktivität in tierischen und/oder menschlichen Zellen. Die Messung dieses Parameters wird für die metabolische Aktivität lebender Zellen herangezogen.
In diesem Testsystem werden die Zellen 24 h mit der Testsubstanz inkubiert, danach werden die Zellen mit XTT (sodium 3’-[1-phenyl-aminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulphonic acid) behandelt. In lebenden Zellen wird durch die aktiven intramito-chondrialen Dehydrogenasen das Tetrazolium-Salz XTT in ein oranges lösliches Formazan umgewandelt. Vollständig inhibierte intramitochondriale Dehydrogenasen können kein Formazan aus XTT bilden. Die Formazanbildung wird photometrisch über ein Microtiterplattenlesegerät quantifiziert und der Grad bzw. die Bewertung der Cytotoxizität der Testsubstanzen kann angegeben werden.
Während in den metabolischen Untersuchungen zur Gluconeogenese (siehe oben) nur akute Effekte von Substanzen bis maximal 60 Minuten erfasst werden können, können mit dem XTT-Test auch Effekte bis zu 24 h bestimmt werden.
In der Zahnklinik wurde/wird mit diesem Test der Einfluss von (Ko)Monomeren und anderen Bestandteilen dentaler Materialien auf die Cytotoxiziät in menschlichen Zellen untersucht. Untersucht wurden bisher die Inhaltsstoffe in Kunststoffzahnfüllungen wie z.B. die (Ko)Monomere TEGDMA, HEMA, UDMA, BisGMA sowie einige Quecksilberver- bindungen (z.B. aus Amalgam) in tierischen und/oder menschlichen Lungen-, Haut-, Nierenzellen, sowie in humanen Pulpa- und Gingivafibroblasten.

COMET-Assay
Der sogenannte Einzelzell-Mikrogelelektrophorese-Test, kurz auch COMET-Assay genannt, ist ein Mutagenitäts-Test.
Hier können die durch mutagene Noxen induzierten Schädigungen der DNA an einzelnen Zellen mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Zunächst werden die Zell- und Kernmembran der untersuchten Zellen durch alkalische Lyse entfernt. Im Anschluss an die nachfolgende Entspiralisierungsphase der DNA können mit dem COMET-Assay die DNA-Veränderungen detektiert werden. Neben Einzelstrangbrüchen des DNA-Moleküls werden auch überkreuzte Vernetzungen zwischen zwei DNA-Molekülen bzw. DNA-Molekülen und Proteinen sowie Einzelstrangbrüche, die im Zusammenhang mit einer unvollständigen Exzisionsreparatur auftreten, entdeckt. Der COMET-Assay hat sich in der Vergangenheit im Vergleich mit vielen anderen labortechnischen Nachweisver¬fahren für mutagene DNA-Veränderungen als überlegen erwiesen. Der wichtigste Vorteil ist neben der sehr hohen Sensitivität dieses Testverfahrens, die außerordentlich niedrige Nachweisbarkeitsgrenze von DNA-Schäden sowie die vergleichsweise einfache praktische Anwendbarkeit.
Sehr stark mutagen wirkende Substanzen wie N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin dienen bei dieser Methode als Positivkontrolle und weisen ein sog. „Olive Tail Mo¬ment“ (OTM) von 35-50 bei hoher Zellvitalität (75-85%) auf. Das OTM ist das Maß für die Intensität der stattgefundenen DNA-Brüche. Als negative Kontrolle wird meistens DMSO-Lösung verwendet, mit einem OTM von 1,0-1,2. Wird bei einer Substanz ein OTM von größer als 2.0 gemessen, kann auf das Vorhandensein mutagener DNA-Effekte geschlossen werden.
Tatsächlich konnten mit diesem Test mutagene Wirkungen von zahnärztlichen Restaurati-onsmaterialien in menschlichen Zellen (z.B. Lymphocyten) entdeckt werden.

Laktat-Dehydrogenase (LDH) Test
Der LDH-Test ist ein sehr häufig angewendeter In-vitro-Zytotoxizitätstest, dessen Prinzip auf der Bestimmung der Enzymaktivität von Laktatdehydrogenase (LDH) im Zytoplasma basiert, das aus zerstörten oder beschädigten Zellen freigesetzt wird und somit im Überstand (in vitro im Zellkulturmedium) nachweisbar ist. Die Laktatdehydrogenase ist ein stabiles zytoplasmatisches Enzym, das sehr schnell in das Zellkulturmedium abgegeben wird, wenn die Zellmembran zerstört ist. Die LDH-Aktivität wird mittels eines enzymatischen Tests bestimmt. Es finden zwei Redoxreaktionen statt: Im ersten Schritt wird Laktat durch die Oxidoreduktase LDH zu Pyruvat oxidiert, während das Coenzym NAD+ durch die Übertragung von Wasserstoff (vom Substrat Laktat) zu NADH/H+ reduziert wird. Im zweiten Schritt transferiert der im Testreagenz enthaltene Katalysator Diaphorase Wasserstoff vom entstandenen NADH/H+ auf das schwach gelbfarbene Tetrazolium-Salz INT (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid), welches dadurch zu dem rot gefärbten Formazan-Salz reduziert wird, während das NADH/H+ zu NAD+ oxidiert wird. Diese Farbstoffbildung kann kolorimetrisch mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 490 nm (Referenzwellenlänge 690 nm) gemessen werden. Je höher der Grad der Zellschädigung ist, desto größer ist die Menge an freigesetztem LDH im Überstand (Medium). Diese Menge an LDH korreliert direkt mit der Menge an gebildetem Formazan-Salz und ist daher direkt proportional zur Anzahl geschädigter Zellen. Als Referenz dienen Kontrollansätze, d.h. Zellen, die unter Zugabe des Detergens Triton-X-100 (1 %, in Zellkulturmedium verdünnt) vollständig lysiert wurden und deren Substratumsetzung daher als maximal (100 %, Positivkontrolle) eingestuft wird, bzw. solche, die nur mit reinem Zellkulturmedium behandelt wurden und deshalb eine minimale (0 %, Negativkontrolle) LDH-Enzymaktivität im Überstand besitzen.
Untersucht wurden bisher die Inhaltsstoffe in Kunststoffzahnfüllungen wie z.B. die (Ko)Monomere TEGDMA, HEMA, UDMA, BisGMA sowie einige Quecksilberverbindungen (z.B. aus Amalgam) in tierischen und/oder menschlichen Lungen-, Haut-, Nierenzellen, sowie in humanen Pulpa- und Gingivafibroblasten.

Cell Proliferation ELISA, BrdU
Lebende (proliferierende) Zellen zeichnen sich unter anderem durch DNA-Synthese, die während der S-Phase der Mitose (Zellteilung) stattfindet, aus. Der BrdU-Test ist ein kolorimetrischer In-vitro-Zytotoxizitätstest, der auf dem Einbau des Pyrimidinanalogons 5-Brom-2-desoxyuridin (BrdU) anstelle der Base Thymidin in die neusynthetisierte DNA proliferierender Zellen beruht. Dadurch können vitale (proliferierende) Zellen nachgewiesen werden. Die DNA wird in diesem Test durch das Reagenz FixDenat denaturiert und ermöglicht somit das Angreifen der Testsystem-Antikörper, die das inkorporierte BrdU detektieren sollen. Durch Zugabe eines Peroxidase-gekoppelten Anti-BrdU-Antikörpers (ein monoklonaler Maus-Antikörper aus Maushybridzellen, Klon BMG 6H8, Fab-Fragmente), der den primären Antikörper gegen BrdU darstellt, entsteht ein Immunkomplex. Das anschließend zugegebene Tetramethylbenzidin (TMB) wird durch die an den BrdU-Anti-BrdU-Komplex konjugierte Peroxidase zu einem blauen Farbstoff umgesetzt, dessen Farbe durch die anschließend zu gegebene Schwefelsäure nach gelb umschlägt. Die photometrische Messung erfolgt bei einer Wellenlänge von 450 nm. Die entstehende Farbintensität korreliert mit der Anzahl lebender (proliferierender) Zellen. Je höher der Grad der Zellschädigung ist, desto niedriger ist die Menge an inkorporiertem BrdU in der neu synthetisierten DNA. Als Referenz dienen Kontrollansätze, d.h. Zellen, die nur dem reinen Zellkulturmedium exponiert werden und deren Substratumsetzung als maximal eingestuft wird (100 % BrdU-Inkorporation).
Untersucht wurden bisher die Inhaltsstoffe in Kunststoffzahnfüllungen wie z.B. die (Ko)Monomere TEGDMA, HEMA, UDMA, BisGMA sowie einige Quecksilberverbindungen (z.B. aus Amalgam) in tierischen und/oder menschlichen Lungen-, Haut-, Nierenzellen, sowie in humanen Pulpa- und Gingivafibroblasten.

Cell Death Detection ELISAPLUS
Der ELISAPLUS-Test (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ist ein kolorimetrisches In-vitro-Testsystem zur Messung von Apoptose und Nekrose. Nekrose ist charakterisiert durch Zellschwellung und nachfolgender Zellmembranruptur (Osmotische Zelllyse) innerhalb von Minuten. Apoptose hingegen ist charakterisiert (bei anfänglicher Zellmembranerhaltung) durch Zeiose (Ausstülpungen der Membran, „blebbing“), Chromatinkondensation und DNA-Fragmentierung durch Aktivierung endogener Endonukleasen und Proteasen. Diese endogenen Endonukleasen, die Ca2+- und Mg2+-abhängig sind, spalten doppelsträngige DNA an ihrer am besten zugänglichen internukleosomalen Linker-Region, wobei Mono- und Oligonukleosomen entstehen. Die DNA dieser Nukleosomen ist eng mit den Kernhistonen H2A, H2B, H3 und H4 verbunden und ist daher vor der weiteren Spaltung der Endonukleasen geschützt. Die Anreicherung der Mono- und Oligonukleosomen ist dadurch bedingt, dass der Abbau der DNA bereits mehrere Stunden vor dem Zusammenbruch der Zellmembran stattfindet. Das Testprinzip beruht auf einem quantitativen Sandwich-Enzym-Immuno-Assay, bei dem die Konzentrationen der Mono- und Oligonukleosomen bei der Apoptose in der Zytoplasma-Fraktion von Zell-Lysaten detektiert wird, bei der Nekrose hingegen im Überstand der behandelten Zellen. Der nekrotische Zelltod ist dadurch gekennzeichntet, dass die Plasmamembran sehr früh zerstört wird und die fragmentierte DNA somit im Zellkulturmedium nachweisbar ist. Zwei verschiedene monoklonale Maus-Antikörper (monoklonale Maus-Antikörper aus Maushybridzellen; Klon H11-4, biotingekoppelt und Klon MCA-33, peroxidasegekoppelt) werden zum Überstand bzw. zum Zell-Lysat hinzu gegeben. Die Überstände bzw. Zell-Lysate müssen dazu vorher in eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte überführt werden, damit eine Bindung der verschiedenen Immunkomplexe an eine Festphase stattfinden kann. Der erste Antikörper ist biotingekoppelt und richtet sich gegen Histone. Durch das Biotin wird dieser Antikörper an der festen Phase (Streptavidin) immobilisiert und bindet an die Histonkomponente der Nukleosomen. Der zweite Antikörper ist peroxidasegekoppelt und bindet an die DNA-Komponente der Nukleosomen. Nach Entfernung der nicht gebundenen Komponenten wird die Nukleosomenmenge durch die im Immunkomplex zurückgehaltene Peroxidase (POD) gemessen. Dabei wird die POD photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm (Referenzwellenlänge 492 nm) mit 2,2´-Azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonat] (ABTS) als Substrat bestimmt. Das dabei detektierte Signal ist proportional zur Menge der immobilisierten Nukleosomen und dadurch auch proportional zur Apoptose- bzw. Nekroserate. Als Referenz dienen Kontrollansätze, d.h. Zellen, die nur dem reinen Zellkulturmedium exponiert werden (Negativkontrolle, minimale Apoptose- und Nekroserate) und deren Substratumsetzung als minimal eingestuft wird und eine Positivkontrolle, bei der fertige DNA-Histon-Komplexe direkt an das Streptavidin gekoppelt wurden und deren Substratumsetzung somit als maximal (100 %) eingestuft wird.
Untersucht wurden bisher die Inhaltsstoffe in Kunststoffzahnfüllungen wie z.B. die (Ko)Monomere TEGDMA, HEMA, UDMA, BisGMA sowie einige Quecksilberverbindungen (z.B. aus Amalgam) in tierischen und/oder menschlichen Lungen-, Haut-, Nierenzellen, sowie in humanen Pulpa- und Gingivafibroblasten.

γ-H2AX-Test
Mit diesem Testsystem lässt sich die Fähigkeit von Substanzen (Xenobiotika) oder Strahlung bestimmen in Zellen Doppelstrang-DNA-Brüche auszulösen. Doppelstrang-DNA-Brüche gelten als Initiatoren bei der Tumorentstehung. Bei diesem Testsystem werden die Zellen (z.B. Gingivafibroblasten, Pulpafibroblasten) mit den zu untersuchenden Substanzen in verschiedenen Konzentrationen zeitabhängig exponiert und dann die resultierenden Doppelstrang-DNA-Brüche quantifiziert.
Änderungen in der Chromatinstruktur verursacht durch spezielle Mechanismen ermöglichen einen Zugang zur dicht verpackten DNA. Dadurch werden die Funktion von Replikation-, Transkriptions- und Reparaturproteinen und die Erkennung oder Markierung der DNA-Schäden innerhalb der Chromatinstruktur ermöglicht. Zu diesen Mechanismen gehören ATP-abhängiges Chromatinremodelling, kovalente Veränderungen von Histonen z.B. Acetylierung, Deacetylierung oder Phosphorylierung, und der Austausch von Histon-Varianten derselben Histonfamilie. Im Zusammenhang mit den kovalenten Veränderungen wird die H2A-Variante als H2AX bezeichnet. Das Histon H2AX ist eine universelle Komponente des Chromatins und kommt außer in niederen Eukaryonten in allen Säugetierzellen vor. Nach Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen erfolgt innerhalb von wenigen Minuten die Phosphorylierung der Histon H2A-Variante H2AX am Carboxy-terminalen Ser-Gln-Glu (SQE) – Motiv an Serin 139. Die Phosphorylierung wird mittels drei einander sehr ähnlichen Proteinkinasen ATM (ataxia telangiectasia mutated protein), ATR (ATM and Rad3-related) und/oder DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) vermittelt. Sie tritt in einer Region von mehreren Hundert bp um den Doppelstrangbruch auf und breitet sich radial aus. ATM ist eine der ersten Kinasen, die nach der Induktion von Doppelstrangbrüchen aktiviert wird; sie gilt als eine zentrale Kinase der DNA-Schadensantwort in Säugetieren.
Diese phosphorylierte Form von H2AX wird als γ-H2AX bezeichnet. γ-H2AX bildet zusammen mit Reparaturproteinen und Proteinen Komplexe, die den Zellzyklus als Checkpointproteine regulieren. Diese Komplexe sind als nukleäre Foci nachweisbar. Zu den beteiligten Reparaturproteinen gehören das 53BP1, der Mre11/Rad50/Nbs1-Komples, Mdc1, Rad 51 und das BRCA1. Dabei hat γ-H2AX in der DNA-Reparatur drei zwei wichtige Funktionen: die korrekte Anordnung der notwendigen Reparaturkomplexe in der Umgebung des DNA-Schadens und die Fixierung der beiden Bruchenden.
Zur Identifizierung und zur Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbrüchen wurden Antikörper entwickelt, die spezifisch gegen die phosphorylierte Form des Proteins gerichtet sind. Mit Hilfe solcher Antikörper, zusammen mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, lassen sich die an den DNA-Doppelsrangbrüchen akkumulierenden γ-H2AX-Moleküle mikroskopisch als so genannte „Foci“ sichtbar darstellen. Die Anzahl der Foci ist dabei direkt proportional der Anzahl der Doppelstrangbrüche. Die quantitative Erfassung von γ-H2AX erfolgt bei dieser Methode durch Anfertigung zweidimensionaler Schnittbilder der Zellkerne mit Laser-Scanning- oder Fluoreszenzmikroskopen. Auf diese Weise entstehen Aufnahmen von Zellen, anhand derer das Zählen der γ-H2AX-Foci pro Zellkern möglich ist. Die Analyse ist sehr zeitaufwändig und erfordert ein hohes Maß an Routine und Erfahrung.
Folgende Bilder zeigen die detektierten Foci (helle Punkte im blau gefärbten Kern) nach Exposition von Gingivafibroblasten mit Medium (Kontrollen) und einigen Komposit-Inhaltsstoffen. Es ergab sich folgende Reihung der Toxizität der Inhaltsstoffe in Komposite: BisGMA > UDMA > TEGDMA > HEMA.

Zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese
Die 2-dimensionale Polyacrylamid Gelelektrophorese ist ein hochauflösendes Verfahren um Proteine aufzutrennen. Bei der 2D-PAGE wird das Proteingemisch zunächst über einen stabilen pH-Gradienten nach unterschiedlichen isoelektrischten Punkten getrennt; anschließend werden die separierten Proteine nach dem Molekulargewicht getrennt. Besonders kleinere Änderungen des Molekulargewichtes, etwa durch Phosphorylierung, betreffen häufig eine funktionelle Gruppe des Peptides und verändern damit meist die isoelektrischen Eigenschaften des Peptides. Damit werden häufig auch regulatorische Änderungen im Protein durch eine 2D-PAGE erkennbar.
Das Verfahren ist äußerst arbeitsaufwendig, da pro Acrylamidgel lediglich 1 Probe analysiert wird, üblicherweise werden dafür aber zwischen 300 bis 500 Peptide (theoretisch bis zu 2000) nach Färbung mit Silber unterscheidbar (sensitivere Proteindetektionsmethoden sind möglich). Geldichte sowie der pH-Gradient können ebenso proteinadaptiert relativ frei gewählt werden. Kommen Proteine aus vitalen Systemen zur Auftrennung (z.B. aus Zellen, Geweben), so kann das Trennverfahren auch nach Einbau von radioaktiven Aminosäuren verwendet werden. Die Detektion erfolgt dann durch eine Radioaktivitätsbestimmung.
Die Trennung des Proteingemisches und Detektion durch übliche Proteinfärbungen und der Einsatz radioaktiv markierter Aminosäuren ergibt zwei völlig verschiedene Aussagen, da im ersteren Fall z.B. auch Veränderungen an bestehenden Proteinen erfaßt werden, während im letzteren Fall lediglich die Proteine detektierbar sind, die zur Zeit der Aminosäuregabe synthetisiert wurden. Beide Detektionsverfahren sind auch miteinander kombinierbar.
Untersucht wurden mit diesem Verfahren vom Mitarbeiter der Arbeitsgruppe, PD Dr. Udo Walther, Walther-Straub-Institut, LMU, bereits die Einflüsse von zahnärztlichen Materialien (z.B. HEMA, TEGDMA, UDMA BisGMA) auf die Proteinsynthese in menschlichen Zellen.

Gas- und Flüssigchromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)
Die Gaschromatographie (GC) stellt innerhalb der Chromatographie (eine Gruppe technischer Trennverfahren) eine spezielle und sehr empfindliche, substanzunabhängige Methode zur Auftrennung von Stoffgemischen dar. Die wichtigste Grundbedingung für die GC ist, dass sich der Analyt, den man untersuchen möchte, unzersetzt verdampfen lässt – sofern er nicht schon gasförmig vorliegt. Der Analyt kann dabei prinzipiell aus jeder beliebigen Matrix stammen.
Allgemeines Prinzip
Die mobile Phase, die das zu analysierende Gemisch enthält, besteht aus einem Gas, z.B. Helium, das durch eine hohle Säule mit einem definierten Innendurchmesser geleitet wird, die von einem bestimmten Material, der stationären Phase, ausgekleidet ist. Das Material der Säulen besteht überwiegend aus mit Polyimid beschichtetem Quarzglas, wobei überwiegend mit Kapillarsäulen gearbeitet wird. Dabei haben die Trennsäulen normalerweise einen Innendurchmesser von 0,2 bis 0,5 mm und eine Länge von 15 bis 60 m. Die stationäre organische Phase kleidet die Kapillare dabei immer nur als dünne Schicht (0,25-5 µm) aus.
Die chromatographische Auftrennung eines Stoffgemisches innerhalb der Säule erfolgt entweder aufgrund der unterschiedlichen Siedepunkte der Einzelsubstanzen in dem Gemisch, wobei keine spezielle Wechselwirkung mit der stationären Phase erfolgt; oder es wird gezielt eine Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase genutzt, um Substanzen zu trennen. Auch die Analyse von Gasgemischen ist so möglich. Durch die unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften der Analyte werden diese auf der Säule voneinander getrennt. Jeder Analyt, der die Säule verlässt, verursacht im an die Kapillare angeschlossenen Massenspektrometer ein Signal, dessen Integral ein Maß für die Konzentration der Substanz in der Probe ist. Gleichzeitig wird auch das korrespondierende Massenspektrum aufgenommen. Die zeitliche Aufzeichnung der Signale wird als Chromatogramm bezeichnet.
Durch Kopplung der GC mit einem Massenspektrometer als Detektor können sehr geringe Substanzmengen nachgewiesen und gleichzeitig Strukturaufklärung betrieben werden.
Diese Vorteile machen die GC-MS zu einem wichtigen Werkzeug in Medizin, Biologie, Lebensmittelchemie, Umweltanalytik und Forensik.
Diese Geräte werden z.Zt. eingesetzt um Intermediate bzw. Metabolite beim Abbau von zahnärztlichen Materialien in biologischen Materialien (z.B. humanen Zellen, Geweben) zu detektieren.

Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)
Unter LC-MS versteht man die Verknüpfung von Flüssigchromatographie (LC (engl. liquid chromatography), häufig auch HPLC) mit der Massenspektrometrie (MS). Dabei dient die Chromatographie, wie in der GC, zur Auftrennung und die Massenspektrometrie zur Identifikation und/oder Quantifizierung der Substanzen.
Die wichtigsten Unterschiede zur GC bestehen darin, dass in der LC eine Flüssigkeit als mobile Phase verwendet wird, die Säulendimensionen deutlich geringer sind (Länge 5-30 cm, ∅ 2-4 mm), die Säulen gepackt (nicht hohl) sind und die Analyten nicht zwingend flüchtig sein müssen.
Die Trennung erfolgt in der LC ausschließlich über die Wechselwirkungen mit der stationären Phase. Zur Analyse im Massenspektrometer wird am Ende der Säule überschüssiger Analyt und vor allem das Lösungsmittel (in der Regel ca. 90 % der Lösung) aus der Chromatographie entfernt und das verbliebene Material mit verschiedenen Gasströmen verdampft. Im Wesentlichen werden hierfür ESI- (Electrospray Ionization) oder APCI- (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Quellen verwendet.

Kombination der Methoden
Durch die Kopplung von LC bzw. GC mit MS steht als Ergebnis für jeden Punkt des Chromatogramms ein Massenspektrum zur Verfügung, womit es möglich wird, die chemische Struktur von Analyten (Analytprofile) oder Fremdsubstanzen (Verunreinigungs- profile) in Gemischen aufzuklären. Wenn die Struktur des Analyten kompliziert ist, müssen Kopplungstechniken angewandt werden. Der Einsatz von MSxMS-Kopplung durch Triple-Quadropol-Geräte oder Ionenfallen verfolgt daher das Ziel, weitere Informationen über die zu untersuchenden Substanzen zu gewinnen.
Die gezielte Kombination aus GC-MS und LC-MS erlaubt es, auch komplizierte Mischungen, bei denen sich die Analyten chemisch sehr stark unterschieden zu analysieren. So werden z.B. Zucker und Aminosäuren mit LC-MS analysiert und leichter flüchtige Substanzen, wie z.B. Aromen und Fettsäuren, mit GC-MS, wobei die Grenzen der Anwendung von GC-MS und LC-MS im Allgemeinen aber fließend sind.
Über einen bewilligten HBFG-Antrag konnte an der Münchner Zahnklinik ein hochmodernes GC-MS und LC-MS-System erworben werden. Es steht seit Oktober 2005 zur Verfügung.
Gegenwärtig werden die Methoden LC-MS und GC-MS sowie deren Kombination zur Aufklärung von Freisetzungen, Abbauwegen und Stoffwechselprodukten aus zahnärztlichen Restaurationsmaterialien und zur Analyse von Luftproben eingesetzt. Hierfür wird zusätzlich eine besondere Art der Probengewinnung, die Headspace-SPME-Methode (SPME = solid phase micro extraction), zur direkten Anreicherung von Analyten aus der Umgebungsluft eingesetzt.

Toxikokinetik von Xenobiotika in vivo

Freisetzung von Zahn-Restmonomeren z.B. aus Kompositen
Die Polymerisation der Monomere und vor allem der Komonomere z.B. in Kompositen verläuft nicht vollständig. Mit Hilfe der Infrarot(IR)-Spektroskopie lässt sich der Prozentsatz an nicht umgesetzten Doppelbindungen im Komposit bestimmen. Durch quantitative Bestimmung wurde für einige Komposite nach zwei Wochen Extrak¬tion in Wasser eine gesamte Restmonomerabgabe in vitro von 0,2-2 Gew% festgestellt.
Eluate aus Kompositen können mit verschiedenen Methoden z.B. der HPLC (High-Performance-Liquid-Chromatography) getrennt werden. Diese haben aber den Nachteil, dass die Identifizierung unbekannter Substanzen nur durch den direkten Vergleich mit Referenzsubstanzen möglich ist.
Einsatz von radioaktiv markierten Zahn-Restaurationsmaterialien
Die Arbeitsgruppe kooperiert weltweit mit einigen Laboren, in denen Xenobiotika radioaktiv markiert werden können. In Zusammenarbeit z.B. mit dem Prins-Maurits-Laboratorium (Niederlande) war es möglich, die radioaktiv markierten (Ko)Monomere 14C-TEGDMA, 14C-HEMA und 14C-BisGMA in genügender Menge zu synthetisieren. Diese wurden dann im Tierexperiment eingesetzt. Die Bestimmungen der 14C-Gehalte in den erwähnten Körperflüssigkeiten bzw. Geweben konnten so durchgeführt und die toxikokinetischen Daten der markierten Substanzen bzw. der Folgeprodukte erhalten werden.
Toxikokinetik von Zahn-Restaurationsmaterialien
Dem Gastrointestinaltrakt kommt bei der (Ko)Monomeraufnahme eine wichtige Rolle zu. Aus den Zahnfüllungen freigesetzte (Ko)Monomere können mit dem Speichel in den Magen-Darm-Trakt und nach der Resorption mit dem Blut in die Organe gelangen. Mit der Methode der Darmperfusion in situ (‘Pendelperfusion’) ist es möglich, sowohl die Menge an radioaktiv markierten (Ko)Monomeren zu bestimmen, die über das Dünn- und Dickdarmepithel resorbiert wird und in die Blutbahn gelangt, als auch die Menge, die mit der Galle ins Darmlumen ausgeschieden wird. Diese Methode wurde von der Arbeitsgruppe entwickelt. Desweiteren lassen sich für (Ko)Monomere evtl. existierende Transportmechanismen für die Ausscheidung mit der Galle, die Plasmahalbwertzeiten, sowie die Zielorgane bei einer Exposition ermitteln.
Mit dieser Methode wurden bereits Resorption, Distribution, Metabolismus und Elimination von (Ko)Monomeren im Tierexperiment ermittelt. Bei der Kurzzeitexposition zeigte sich die Niere als das Zielorgan, bei längeren Expositionszeiten mit (Ko)Monomeren waren in der Leber die höchsten 14C-Gehalte zu finden.
Im Haus stehen sämtliche Geräte zur Verfügung zur Ermittlung der Toxikokinetik von Substanzen im Tierversuch. Dafür wurden spezielle Stoffwechselkäfige entwickelt, die es gestatten, vom Tier gebildete (sogar gasförmige) Intermediate nach Exposition mit Radio-Xenobiotika zu ermitteln. Tatsächlich wurde sogar die Bildung von gasförmigen 14C-Metaboliten beim Abbau von 14C-(Ko)Monomeren aus Zahnfüllungen im Tierversuch nachgewiesen.
Es konnte gezeigt werden, dass z.B. die Exhalation den Hauptweg der Elimination des Kohlenstoff-Labels der untersuchten (Ko)Monomeren bzw. deren Metabolite darstellt.

Bildung von toxischen Metaboliten beim Abbau von (Ko)Monomeren im Organismus
Aus den Ergebnissen der toxikokinetischen Untersuchungen mit radioaktiv markierten Substanzen im Tierversuch konnte inzwischen für einige (Ko)Monomere sogar die Bildung von toxischen (höchstwahrscheinlich mutagenen/cancerogenen) Intermediaten nachgewiesen werden.
Mit dieser Methode ist es möglich nahezu für jede Substanz den Ausscheideweg bzw. das Metabolisierungsmuster in vivo schnell zu ermitteln. Diese Daten sind unabdingbar für eine vernünftige und wissenschaftlich fundierte Risikobewertung von Xenobiotika.

Tierversuchs- und Ethikantragstellungen
Für die Durchführung eines Tierexperiments ist ein von der Regierung von Oberbayern bewilligter Tierversuchsantrag notwendig. Der Autor dieser Website ist seit über 25 Jahren tierexperimentell tätig und Leiter einer Reihe weiterer bewilligter Tierversuchsvorhaben. Die gesamte Antragstellung für die Durchführung eines Tierexperiments für die Testung relevanter Medizinprodukte und/oder Medikamenten kann übernommen werden.
Das Gleiche gilt für die Durchführung von Klinischen Untersuchungen, für die ein von der Ethikkommission bewilligter Ethikantrag notwendig ist. Auch hier kann die gesamte Antragstellung für die Durchführung dieser Studien für die Testung z.B. relevanter Medizinprodukte und/oder Medikamenten übernommen werden.